في تخصص Biotechnology اكيد يهمك انك تعرف كميه كبيرة من التقنيات والmethods عشان تعرف تستغلها في المعمل وعشان كدة احنا جمعنالك علي مدار شهر رمضان تقنيات مختلفه واساليب مختلفه وجمعناهالك هنا في بوست واحد عشان تعرف ترجعلها اي وقت تحبه وطبعا متنساش تعمل شير عشان الفايدة تعم ويكون دعم لينا :-
بواسطة | Organized
1- RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism:
- فى علم البيولوجيا الجزيئية ، تقنية ال RFLP تستغل الاختلافات فى تسلسلات الحمض النووى المتجانسة ، والمعروفة باسم polymorphism ، من اجل التمييز بين الافراد او السكان او الانواع او لتحديد مواقع الجينات داخل التسلسل.
- وهي اختلافات بين الأفراد في أطوال قطع ال DNA التي تقطعها الإنزيمات..
إنزيمات القطع – Restriction enzymes هي انزيمات تقطع الحمض النووي في تسلسلات قصيرة وفى اماكن محددة تسمى مواقع القطع – Restriction sites..
- بعد قطع جزء من الحمض النووي إلى قطع عن طريق إنزيمات القطع ، يمكن للباحثين فحص القطع المختلفة باستخدام طريقة مخبرية تسمى ب التفريد الكهربى - gel electrophoresis ، والتي تفصل قطع الحمض النووي وفقًا لحجمها.
- إذا كان لدى شخصين اختلافات في تسلسلات الحمض النووي في مواقع القطع ، فإن إنزيمات القطع ستقطع الحمض النووي إلى قطع ذات أطوال مختلفة.
- قد يكون هناك أيضًا اختلافات في عدد أجزاء الحمض النووي التي لوحظت بين شخصين أو أكثر.
- يمكن استخدام تحليل RFLP كشكل من أشكال الاختبار الجيني لمراقبة ما إذا كان الفرد يحمل جينًا متحورًا لمرض ينتشر في عائلته ..
فا اذا اراد احد الباحثين ان يفرق بين نمط وراثي بين اثنين من الانواع فسيقوم:
1- باستخراج ال DNA من كليهما
2- ثم سيقوم بقطع ال DNA باستخدام restriction enzyme
3- ومن ثم سيقوم بتحميل العينات اللى gel electrophoresis ليدرس الاختلافات!
2- Native PAGE
هو واحد من التقنيات المستخدمة في تكنولوچيا التفريد الكهربي أو الGel Electrophoresis
- وهو بيستخدم عشان نعرف نحدد بيه الشكل والشحنة والوزن الطبيعين للبروتين.
- وفى هذه التقنية يتم فصل البروتين فى حالته الاساسية ثلاثية الابعاد (Native protein) حيث انه لا يتم عمل denaturation للبروتين , و بيتم الفصل عشان معظم البروتينات بتكون سالبة الشحنة negatively charged في المحلول القلوي الخاص بالتكنيك ده ، وعند التعرض لل gel electrophoresis ، ف طبعا كل ما كانت شحنة البروتين السالبة عالية في المحلول القلوي كل ما زاد سرعة جريانه migration في الچيل ، وفى نفس الوقت: اثناء الفصل بيكون فيه قوة احتكاك بين البروتينات المختلفة والچيل والنتيجة أن البروتين الي حجمه صغير بتحتك بالچيل بشكل أقل من البروتينات اللى حجمها أكبر و بالتالي هنا هيكون التحكم فى الحركة والفصل بالنسبة لمبدأ الحجم والشكال ثلاثى الأبعاد..
- وعليه البروتين بيتفصل علي اساس الشحنة والحجم والشكل ثلاثي الأبعاد
بس مش بسبب توحيد الشحنة وعمل denaturation زي ما بيحصل في ال
SDS PAGE.
3 –microarray
- هي واحدة من اهم التقنيات في ال biotechnology اللى بتقدر تقيس التعبير الجيني لجينات معينة فى العينة بتاعتنا والمقارنة بين التعبير الجينى الطبيعى للجينات فى الخلايا الطبيعية ونظيرتها فى الخلايا السرطانية ..
- بتم عن طريق التكامل -hybridization بين اجزاء مكملة للجين - probe اللى بنحطها على شريحة عشان تقابل ال cDNA الخاص بالعينة اللى انت حطيتها عشان تشوف فيها التعبير الجينى..
وطبعا ليها اكتر من نوع زي protein microarray وغيرها وعلي الرغم ان فيه تقنيات ادق واقوي طلعت بعدها , تفضل تقنية ال microarray محافظه علي رونقها ..وبتتم خطواتها كالتالي :
(١) فى الاول بنستخرج ال mRNA من كلتا العينتين ، الخلية السرطانية والخلية الطبيعية.
(٢) وبعد كدة هنحول لل mRNA الىcDNA.
(٣) العينة السرطانية ال cDNA بتاعها هنديلهاfluorescent dye باللون الاحمر ،، اما العينة ال healthy هنديها اللون الاخضر.
(٤) وبعد كدة هنعرض ال cDNA للشريحة بتاعت الmicroarray.
(٥) وعن طريق عملية ال hybridization لما تحصل بين الشريحة والعينة ، ال fluorescent هتظهر
(٦) ومن خلال laser beam نقدر نdetect الfluorescent دي.
(٧) ومن خلال الكومبيوتر نقدر نحلل ال data اللى طالعة!
4 –Southern blotting
التقنيه دي هي واحدة من تقنيات ال blotting او اللطخه وهي تقنيات بقدر اعمل detection بيها لمكون معين او هدف معين.. بنستخدم التقنيه الي معانا انهاردة southern blotting في اننا نعرف لوجود تتابع ((DNA)) معين جوا العينه وهي كانت من التقنيات الثوريه الي اتسمت علي اسم العالم الي ابتكرها والي اتسمي علي نفس نهجها بعد كدة باقي تقنيات ال Blotting الي طلعت بعدها ..
التقنيه بتتم كالتالي:
1- نستخلص ال DNA من العينه
2 - نقطعه ب Restriction enzyme
3- نعمل loading علي gel electrophoresis
4- ننقل الbands علي nylon paper بالخاصيه الشعريه
5- نحط probes معلمه ومكمله للتتابع الي عاوزينه علي ال paper عشان اقدر اكشف على وجود تتابع ال DNA الخاص اللى ببحث عنه
5- Northern Blotting
علي نفس نهج southern blotting بتقدر northern انها تحدد وجود تتابع (mRNA) في العينه
تتم عن طريق:
1- عزل ال RNA من العينة RNA Extraction ..
2- فصل ال RNA عن طريق الحجم عند التعرض لتيار كهربى من خلال ال electrophoresis.داخل Alkaline nature للجيل
3- نقل ال RNA الى nylon membrane .. خطوة ال blotting.
4- وضعlabeled probes مخصصة حتى ترتبط بال RNA المخصص الذى نريد ان نبحث عنه ومن ثم تظهر اضاءة فلورسينتية يتم الكشف عنها.
6 - western blotting
في المرة دي انا بكشف عن وجود بروتين معين جوا العينه بكميات اقل من ان ال ELISA تقدر تكشفها او الطرق المعمليه العاديه التانيه وهنا بستخدم الخطوات التاليه:
1- بستخرج البروتين من العينه – protein extraction
2- بنفصل البروتين عن طريق خطوة التفريغ الكهربى علي SDS PAGE
3- بنحط الجيل في blotting tank يقدر النقل البروتين لل nitrocellulose sheet
4- بنقل ال sheet دي ل tank تاني اقدر من خلاله اني اضيف علي الورقه primary antibody يقدر يمسك في البروتين بتاعي المراد الكشف على وجوده فى العينة وبعده secondary antibody ليه جزء مربتط ب انزيم يقدر يتفاعل مع ال substrate بتاعه عشان يديني لون او ممكن يكون هو radioactive labeled اقدر اكشف عنه على وجود البروتين.
7- DOT Blotting
علي عكس التقنيات الي فاتت في نوع تاني من ال blotting اسمه ال Dot blotting بستخدم فيه ال sheet بشكل مباشر عشان انقل واقيس العينه على طول ، وال sheet ده هو نفسه بيكون مكان الارتباط بين العينه وال probe
- البروتوكول العام هو وضع 1-2 ميكروليترز من العينات على النيتروسلولوز والسماح لها انت تجف..
- يتم عمل incubation للغشاء بى blocking buffer عشان يمنع اى non-specific binding ممكن تحصل
ثم يتم اضافة الأجسام المضادة الأولية تليها الأجسام المضادة الثانوية.
بعد حدوث ال antibody binding، يتم عمل incubation للغشاء مع chemiluminescent substrate وتصويره حتى نحدد من وجود البروتين فى العينة
8- FISH (Fluorescent In Situ Hybridization - FISH) ..
وهى تقنية ( molecular cytogenetics ) بستخدم من خلالها fluorescent probe اللى هترتبط فقط بالاجزاء المكملة لها من تسلسل الحمض النووى بدرجة عالية .. وبتستخدم للكشف عن وجود أو عدم وجود تسلسلات معينة من الحمض النووى على الكروموسومات وتحديد موقعها!
وبتم عن طريق:-
1- تحضيرProbe يكون مكمل للتسلسل المعروف اللى بنحبث عنه
2- قم بتمييز ال Probe عن طريق Fluorescent marker
3- ضع الكروموسومات على شريحة
4- اضافة الfluorescent probe الى الكروموسومات على الشريحة ، مما يسمح لعملية التكامل ان تتم بين ال Probe والsequence المكمل ليه على الكروموسوم
5- لاحظ الكروموسومات تحتFluorescent microscope ، وسيظهر اضاءة عند مواقع الارتباط بين ال probe والsequence اعتمادًا على عدد المواقع التي يمكنه التهجين والتكامل فيها!
9- ELISA
هي تقنيه من تقنيات الserological test اللى ليها طرق كتير(direct ELISA .. indirect .. sandwich .. competitive ) ..
بس الاساس العلمي الي فيها هو تفاعل antigen مع antibody ومن خلالها نقدر الكشف عن المواد القابلة للذوبان وقياسها مثل الببتيدات والبروتينات والأجسام المضادة والهرمونات
من خلالها يمكن الكشف عن وجود فيروس الايدز HIV فى عينة المريض
تتم عن طريق استخدام ال Antigen المستخلص من serum المريض واضافته إلى ال plate اللى متثبت فيها Antibody خاص بال Antigen ده وبعد كدة بنعمل wash و اضافه secondary antibody عشان يمسك فى ال antibody الاولانى ويكشف عن ارتباطه بال antigen ولا لأ عشان نقدر نعمل detection للارتباط ده
ممكن يجيلك شويه حيرة في الفرق بين ال western blotting وال ELISA وعشان نبعد عنك الحيرة دي في كذا فرق بسيط خلي بالك منهم
1- الwestern بتقدر تأكد علي النتايج الخاصه بال ELISA لانها اكثر دقه واقل في معدل الخطأ عن ELISA
2- ال ELISA اقدر اكشف بيها عن ال Antibody مش بس ال antigen لان في بعض ال kits بيكون جي فيها ال antigen والserum بيكون فيه الAntibody
10- immuno-PCR
هي تقنيه من تقنيات الPCR الي بتكشف مش عليDNA لا عن بروتين وبيتم استخدامها عشان يتم الكشف عن كميات قليله جدا من بروتين معين جوا عينه محدودة الكميه .. لذلك بتتم التقنيه علي كذا خطوة ..
1- بيكون متجهز primary Antibody اول ما بيلاقي البروتين المراد الكشف عنه بيمسك فيه
2- بعد كدة بيتم اضافه secondary Antibody حاصله attachment مع تسلسل من الDNA في احد اطرافه
3- بندخل ال microtiter plate دي مع مكونات ال real time PCR في الجهاز وزي الreal time PCR العادي بنقرأ الزيادة في معدل التضاعف من خلال florescence
4- تحليل النتايج ..لو تفاعل ال PCR تم واداني اشاره ده بيكون دليل علي وجود البروتين ده في العينه ..لو متمش او اداني اشاره ضعيفه بيكون اشاره علي وجود نسبه البروتين او عدمه في العينه
>> من ضمن عيوب التقنيه دي هي انها مكلفه بحيث دمج ال DNA مع الSecondary antibody ومحتاجه خبراء في التعامل معاها..
11- sanger sequencing
هي واحدة من اهم تقنيات الFirst generation Sequencing واتسمت بكدة نسبه للعالم الي ابتكرها وكانت واحدة من اهم التقنيات الي ساعدت في تقدم ال sequencing واهم خطواته (مشروع الجينوم البشري) وبيكون غرض التقنيه طبعا هي معرفه تتابعات ال DNA او قرايته علي الجيل .
بيتم تحضير التقنيه عن طريق
1- تحضير 4 اوساط تحتوي علي مكونات ( انزيم بلمرة DNA polymerase - وجزيئات معلمة dideoxynucleotide , كل وسط يحتوي علي نوع معين من القواعد المعلمه – ونيوكلوتيدات DNA حرة Adenine-cytosine-thiamine-guanine )
2- ثم يتم اضافة القطع الي الاوساط المختلفة وتركها فترة تسمح بتكرار DNA من خلال انزيم ال DNA polymerase
3- ومن ثم يتم تحميل العينات الي capillary electrophoresis واخذ بيانات التسلسل اللى هتعدى من خلال الانبوبة ديه وهنا هيتم الفصل ومن خلال تعريض ليزر على النيكليوتيدات المارة خلال الانبوبة سيتم تحليل البيانات عن طريق ظهور Peaks مختلفة للنيوكليوتيدات المارة وهنا سيتم قراءة التسلسل.
12- pyrosequencing
طريقة لمعرفة الDNA sequence عن طريق تحديد انتاج ال pyrophosphate عن طريق تحديد الضوء الخارج..
تضاف النيوكليوتيدات بشكل متكرر إلى التفاعل ، يتم إطلاق بيروفوسفات (PPi).
يؤدي PPi إلى سلسلة من التفاعلات التي تؤدي إلى إنتاج الضوء ، والذي يتناسب مع كمية الحمض النووي وعدد النيوكليوتيدات المدمجة.
يتم الكشف عن الضوء المولد وتسجيله بواسطة Detector system على شكل .signal peaks .
يتم تحضير قطع DNA مع استخدام انزيمات DNA polymerase و ATP sulfurylase و Apyrase و luciferin substrate.
1- يرافق كل حدث دمج للنيوكليوتيدات إطلاق مادة بيروفوسفات (PPi)
2- إطلاق PPi يؤدي إلى تفاعل ATP sulfurylase وهذا يؤدى لتحويل البيروفوسفات الى ATP
3- يقوم انزيم ال luciferase محول الATP الى light هنا نقدر نعملها detection
3- ويجي انزيم الapyrase يشيل الnucleotide الزيادة الي مش تبع التتابع المطلوب
وبعدين تطلع النتائج في شكلgraph والداتا علي حسب الpeak
هو زيSanger method بس مش بنفس الكفائة ، كفائته 98% وده مش وحش خالص غير إنه كمان أرخص ومتوفر أكتر تجارياً.
13 - CHIP-SEQ
وهى طريقة تستخدم لتحديد مواقع ربط الحمض النووى(DNA) على نطاق الجينوم بعوامل النسخ Transcription Factors والبروتينات الأخرى ، عن طريق دمج خاصيتين وهم
(immunoprecipitation)مع (DNA sequencing)
عن طريق :
1- ترسيب ال DNA اللى يرتبط بالبروتين باستخدام antibodies يعملtargeting للبروتينات ديه.
2- فصل ال DNA عن البروتين.
3- عمل DNA Sequencing لتحديد مواقع ارتباط البروتين على ال DNA.
14- edman degradation
وهي تقنيه من تقنيات معرفه تسلسل البروتين بيتم فيها استخدام مركب phenylisothiocyanate ال
N-Terminal animo acid للتفاعل مع
وبعد مجموعه من التفاعلات الحمضيه بيحصل فصل للحمض الاميني الطرفي الي مربوط مع ال phenylisothiocyanate
وبتتكرر العمليه دي اكتر من مرة عشان تعرفنا تسلسل البروتين ده ايه ..
طبعا العمليه دي بتاخد وقت ومجهود وفيها نسبه خطأ كبيرة لو كان البروتين حجمه كبير نسبيا لكن كانت واحدة من الطرق الاوليه لمعرفه تسلسل البروتين
15- Chromatography
- ال Chromatography هى تقنية مختبرية لفصل الخليط...
- يذوب الخليط في سائل يسمى الطور المتحرك Mobile phase، والذي يحمله من خلال هيكل يحمل مادة أخرى تسمى المرحلة الثابتةStationary Phase.
- تنتقل المكونات المختلفة للخليط بسرعات مختلفة ، مما يؤدي إلى انفصالها. يعتمد الفصل على التقسيم التفاضلي بين المرحلتين المتنقلة والثابتة!
16- Molecular typing techniques
عشان نقدر نعرف بكتريا معينه فساعتها بنلجأ ل اكتر من طريقه منهم الطرق الchemical reactions الي بتعتمد علي افرازات معينه من البكتريا وتفاعلها مع البيئه او طرق molecular ودي كتير جدا منهمELISA ومنهمPCR ومنهمsequencing ..
بس احنا هنا هنهتم بالsequencing اكتر في طرق قديمه وطرق حديثه شويه من اهم الطرق دي :
16s rRNA:
ودي بتتم عن طريق استخراج وعزل ال DNA وعمل PCR خاص بالجزء الخاص بال 16s rRNA الخاص بالبكتريا دي بعد كدة استخدام الhigh throughput sequencing لل 16s rRNA عشان نعرف تتابع الجزء ده وانتمائه ل اي نوع بكتريا وفصيله ونقدر نحلل بياناته ونحطه فيphylogeny خاص بيه..
MLST Multi-locus sequence typing :
وده بيعتمد علي استخدام اكتر من house-keeping gene جوا البكتريا علي عكس ال 16s rRNA اللى بيستهدف جين واحد بس ،وفى الاغلب بيكونوا 7 جينات مستهدفه وبتكون من ضمن مزاياه انه بيدي رقم ثابت لكل تسلسل فريد في كل كل جين وبيتم جمعهم عشان يديني كود مخصوص بيعرف ويثبت البكتريا دي بخصائصها وتسلسلها .. وكمان ليها database خاصه بيها( https://pubmlst.org/ ).
PULSED field gel electrophoresis :
وهنا احنا بنستخدم انزيمات قطع (restriction enzyme) عشان نقطع الجينوم البكتيري لقطع كبيرة وطبعاpattern القطع بيختلف حسب البكتريا والجينوم الي بيغير معاه طبعا الsite الي بيتم القطع فيه وبيتم تحميل القطع دي عليpulsed field gel والي بيكون شكله سداسي نوعا ما عشان نقدر نغير في اتجاه التيار الكهربي ويدينا pattern معين ومن ضمن الي بيميزه عن ال gel electrophoresis العادي في كتير من الحاجات اولهم انه بيقدر يحمل حجم اكبر من الdna من العادي وكمان خطواته الي بتكون
1- مزج البكتريا مع melted agarose gel
2- تقطيع الجينوم بعدد محدود من القطع
3- تحميل القطع علي ال PFGE
4- تصوير العينات ..
من ضمن عيوب التقنيه دي هي انها بطيئه بتاخد اكتر من يوم للتحضير
وطبعا من اهم الطرق استخدام ال Whole genome sequencing
والي بيدي تفاصيل اكتر عن البكتريا الي محتاجين نعرفها عشان نقدر نعملهاcharacterization عشان نقد نصمم ليها الطرق الرئيسية لتثبيط الوباء والقضاء عليه.
17- Ames assay
اختبار بعرف بيه لو الماده الي معايا دي ممكن تسبب طفرات او لا
عن طريق اني بحط الماده دي مع بكتريا متحورةmutant مبتقدرش تخلق الHistidine وبالتالي مش هتقدر تنمو لو مش موجود في الوسط بتاعها لكن لو حصلها طفرة فهي هتقدر ترجع تاني تخلقه وبالتالي لو حضنت البكتريا لمدة 24 ساعه مع المادة في وسط مفيهوش Histidine مش هتنمو ..
دي تقنيه من الطرق الي بستخدمها عشان اقيم المادة الي عندي ولكنها مش الوحيدة وواحدة من عيوبها هي انها ممكن تحصل طفرة تلقائيه ميكونش السبب فيها هي المادة دي ولكن بنقدر نفرق بينهم عن طريق النمط الخاص بالنمو البكتيري علي الطبق.
18 - Comet Assay
واحد من الاختبارات اللى بتكشف عن الكسور او ال Damage اللى بيحصل فى ال DNA..
بيتم عن طريق
1- وضع الخلية فى low melting agarose ،
2- وبعدها بيتم تحليل الخلايا فى ظروف قاعدية alkaline ، و محلول تحليلlysis solution عشان نضمن ان مفيش اى شوائب من الprotein ، ونضمن ان ال DNA يفك ويكون unwinded ..
3- بعدها بنعرض الشريحة إلىelectrophoresis و نصبغها ..
فا بالتالى يكون هناك حركة مرئية للجزيئات(Damaged DNA) بفعل التيار الكهربى بعيدا عن ال intact DNA
19 - Mutagenesis
هى طريقة من خلالها يتم عمل mutation معينة لل DNA لانتاج غرض معين..
قد ينتج عن الطفرة بروتينات متحولة ذات خصائص مثيرة للاهتمام أو وظائف محسنة أو جديدة قد تكون ذات فائدة تجارية.
توجد العديد من طرق الطفرات اليوم .. في البداية ، كانت الطفرات التى يتم انتاجها معمليا كانت بصورة عشوائية وغير متخصصة تمامًا. ومع ذلك ، مع التطور توصل الى ان الطفرات تكون موجهة للموقع ، يمكن إجراء تغييرات أكثر تحديدًا .. فمنذ عام 2013 ، سمح تطوير تقنية CRISPR / Cas9، استنادًا إلى نظام دفاع فيروسي بدائي النواة ، بتحرير أو تغيير الجينوم في الجسم الحى وهو ثورة فى عالم ال Genome editing لعلاج الامراض الوراثية وتطوير حالة النبات من الجفاف ومقاومة الامراض
بواسطة | Organized
1- RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism:
- فى علم البيولوجيا الجزيئية ، تقنية ال RFLP تستغل الاختلافات فى تسلسلات الحمض النووى المتجانسة ، والمعروفة باسم polymorphism ، من اجل التمييز بين الافراد او السكان او الانواع او لتحديد مواقع الجينات داخل التسلسل.
- وهي اختلافات بين الأفراد في أطوال قطع ال DNA التي تقطعها الإنزيمات..
إنزيمات القطع – Restriction enzymes هي انزيمات تقطع الحمض النووي في تسلسلات قصيرة وفى اماكن محددة تسمى مواقع القطع – Restriction sites..
- بعد قطع جزء من الحمض النووي إلى قطع عن طريق إنزيمات القطع ، يمكن للباحثين فحص القطع المختلفة باستخدام طريقة مخبرية تسمى ب التفريد الكهربى - gel electrophoresis ، والتي تفصل قطع الحمض النووي وفقًا لحجمها.
- إذا كان لدى شخصين اختلافات في تسلسلات الحمض النووي في مواقع القطع ، فإن إنزيمات القطع ستقطع الحمض النووي إلى قطع ذات أطوال مختلفة.
- قد يكون هناك أيضًا اختلافات في عدد أجزاء الحمض النووي التي لوحظت بين شخصين أو أكثر.
- يمكن استخدام تحليل RFLP كشكل من أشكال الاختبار الجيني لمراقبة ما إذا كان الفرد يحمل جينًا متحورًا لمرض ينتشر في عائلته ..
فا اذا اراد احد الباحثين ان يفرق بين نمط وراثي بين اثنين من الانواع فسيقوم:
1- باستخراج ال DNA من كليهما
2- ثم سيقوم بقطع ال DNA باستخدام restriction enzyme
3- ومن ثم سيقوم بتحميل العينات اللى gel electrophoresis ليدرس الاختلافات!
2- Native PAGE
هو واحد من التقنيات المستخدمة في تكنولوچيا التفريد الكهربي أو الGel Electrophoresis
- وهو بيستخدم عشان نعرف نحدد بيه الشكل والشحنة والوزن الطبيعين للبروتين.
- وفى هذه التقنية يتم فصل البروتين فى حالته الاساسية ثلاثية الابعاد (Native protein) حيث انه لا يتم عمل denaturation للبروتين , و بيتم الفصل عشان معظم البروتينات بتكون سالبة الشحنة negatively charged في المحلول القلوي الخاص بالتكنيك ده ، وعند التعرض لل gel electrophoresis ، ف طبعا كل ما كانت شحنة البروتين السالبة عالية في المحلول القلوي كل ما زاد سرعة جريانه migration في الچيل ، وفى نفس الوقت: اثناء الفصل بيكون فيه قوة احتكاك بين البروتينات المختلفة والچيل والنتيجة أن البروتين الي حجمه صغير بتحتك بالچيل بشكل أقل من البروتينات اللى حجمها أكبر و بالتالي هنا هيكون التحكم فى الحركة والفصل بالنسبة لمبدأ الحجم والشكال ثلاثى الأبعاد..
- وعليه البروتين بيتفصل علي اساس الشحنة والحجم والشكل ثلاثي الأبعاد
بس مش بسبب توحيد الشحنة وعمل denaturation زي ما بيحصل في ال
SDS PAGE.
3 –microarray
- هي واحدة من اهم التقنيات في ال biotechnology اللى بتقدر تقيس التعبير الجيني لجينات معينة فى العينة بتاعتنا والمقارنة بين التعبير الجينى الطبيعى للجينات فى الخلايا الطبيعية ونظيرتها فى الخلايا السرطانية ..
- بتم عن طريق التكامل -hybridization بين اجزاء مكملة للجين - probe اللى بنحطها على شريحة عشان تقابل ال cDNA الخاص بالعينة اللى انت حطيتها عشان تشوف فيها التعبير الجينى..
وطبعا ليها اكتر من نوع زي protein microarray وغيرها وعلي الرغم ان فيه تقنيات ادق واقوي طلعت بعدها , تفضل تقنية ال microarray محافظه علي رونقها ..وبتتم خطواتها كالتالي :
(١) فى الاول بنستخرج ال mRNA من كلتا العينتين ، الخلية السرطانية والخلية الطبيعية.
(٢) وبعد كدة هنحول لل mRNA الىcDNA.
(٣) العينة السرطانية ال cDNA بتاعها هنديلهاfluorescent dye باللون الاحمر ،، اما العينة ال healthy هنديها اللون الاخضر.
(٤) وبعد كدة هنعرض ال cDNA للشريحة بتاعت الmicroarray.
(٥) وعن طريق عملية ال hybridization لما تحصل بين الشريحة والعينة ، ال fluorescent هتظهر
(٦) ومن خلال laser beam نقدر نdetect الfluorescent دي.
(٧) ومن خلال الكومبيوتر نقدر نحلل ال data اللى طالعة!
4 –Southern blotting
التقنيه دي هي واحدة من تقنيات ال blotting او اللطخه وهي تقنيات بقدر اعمل detection بيها لمكون معين او هدف معين.. بنستخدم التقنيه الي معانا انهاردة southern blotting في اننا نعرف لوجود تتابع ((DNA)) معين جوا العينه وهي كانت من التقنيات الثوريه الي اتسمت علي اسم العالم الي ابتكرها والي اتسمي علي نفس نهجها بعد كدة باقي تقنيات ال Blotting الي طلعت بعدها ..
التقنيه بتتم كالتالي:
1- نستخلص ال DNA من العينه
2 - نقطعه ب Restriction enzyme
3- نعمل loading علي gel electrophoresis
4- ننقل الbands علي nylon paper بالخاصيه الشعريه
5- نحط probes معلمه ومكمله للتتابع الي عاوزينه علي ال paper عشان اقدر اكشف على وجود تتابع ال DNA الخاص اللى ببحث عنه
5- Northern Blotting
علي نفس نهج southern blotting بتقدر northern انها تحدد وجود تتابع (mRNA) في العينه
تتم عن طريق:
1- عزل ال RNA من العينة RNA Extraction ..
2- فصل ال RNA عن طريق الحجم عند التعرض لتيار كهربى من خلال ال electrophoresis.داخل Alkaline nature للجيل
3- نقل ال RNA الى nylon membrane .. خطوة ال blotting.
4- وضعlabeled probes مخصصة حتى ترتبط بال RNA المخصص الذى نريد ان نبحث عنه ومن ثم تظهر اضاءة فلورسينتية يتم الكشف عنها.
6 - western blotting
في المرة دي انا بكشف عن وجود بروتين معين جوا العينه بكميات اقل من ان ال ELISA تقدر تكشفها او الطرق المعمليه العاديه التانيه وهنا بستخدم الخطوات التاليه:
1- بستخرج البروتين من العينه – protein extraction
2- بنفصل البروتين عن طريق خطوة التفريغ الكهربى علي SDS PAGE
3- بنحط الجيل في blotting tank يقدر النقل البروتين لل nitrocellulose sheet
4- بنقل ال sheet دي ل tank تاني اقدر من خلاله اني اضيف علي الورقه primary antibody يقدر يمسك في البروتين بتاعي المراد الكشف على وجوده فى العينة وبعده secondary antibody ليه جزء مربتط ب انزيم يقدر يتفاعل مع ال substrate بتاعه عشان يديني لون او ممكن يكون هو radioactive labeled اقدر اكشف عنه على وجود البروتين.
7- DOT Blotting
علي عكس التقنيات الي فاتت في نوع تاني من ال blotting اسمه ال Dot blotting بستخدم فيه ال sheet بشكل مباشر عشان انقل واقيس العينه على طول ، وال sheet ده هو نفسه بيكون مكان الارتباط بين العينه وال probe
- البروتوكول العام هو وضع 1-2 ميكروليترز من العينات على النيتروسلولوز والسماح لها انت تجف..
- يتم عمل incubation للغشاء بى blocking buffer عشان يمنع اى non-specific binding ممكن تحصل
ثم يتم اضافة الأجسام المضادة الأولية تليها الأجسام المضادة الثانوية.
بعد حدوث ال antibody binding، يتم عمل incubation للغشاء مع chemiluminescent substrate وتصويره حتى نحدد من وجود البروتين فى العينة
8- FISH (Fluorescent In Situ Hybridization - FISH) ..
وهى تقنية ( molecular cytogenetics ) بستخدم من خلالها fluorescent probe اللى هترتبط فقط بالاجزاء المكملة لها من تسلسل الحمض النووى بدرجة عالية .. وبتستخدم للكشف عن وجود أو عدم وجود تسلسلات معينة من الحمض النووى على الكروموسومات وتحديد موقعها!
وبتم عن طريق:-
1- تحضيرProbe يكون مكمل للتسلسل المعروف اللى بنحبث عنه
2- قم بتمييز ال Probe عن طريق Fluorescent marker
3- ضع الكروموسومات على شريحة
4- اضافة الfluorescent probe الى الكروموسومات على الشريحة ، مما يسمح لعملية التكامل ان تتم بين ال Probe والsequence المكمل ليه على الكروموسوم
5- لاحظ الكروموسومات تحتFluorescent microscope ، وسيظهر اضاءة عند مواقع الارتباط بين ال probe والsequence اعتمادًا على عدد المواقع التي يمكنه التهجين والتكامل فيها!
9- ELISA
هي تقنيه من تقنيات الserological test اللى ليها طرق كتير(direct ELISA .. indirect .. sandwich .. competitive ) ..
بس الاساس العلمي الي فيها هو تفاعل antigen مع antibody ومن خلالها نقدر الكشف عن المواد القابلة للذوبان وقياسها مثل الببتيدات والبروتينات والأجسام المضادة والهرمونات
من خلالها يمكن الكشف عن وجود فيروس الايدز HIV فى عينة المريض
تتم عن طريق استخدام ال Antigen المستخلص من serum المريض واضافته إلى ال plate اللى متثبت فيها Antibody خاص بال Antigen ده وبعد كدة بنعمل wash و اضافه secondary antibody عشان يمسك فى ال antibody الاولانى ويكشف عن ارتباطه بال antigen ولا لأ عشان نقدر نعمل detection للارتباط ده
ممكن يجيلك شويه حيرة في الفرق بين ال western blotting وال ELISA وعشان نبعد عنك الحيرة دي في كذا فرق بسيط خلي بالك منهم
1- الwestern بتقدر تأكد علي النتايج الخاصه بال ELISA لانها اكثر دقه واقل في معدل الخطأ عن ELISA
2- ال ELISA اقدر اكشف بيها عن ال Antibody مش بس ال antigen لان في بعض ال kits بيكون جي فيها ال antigen والserum بيكون فيه الAntibody
10- immuno-PCR
هي تقنيه من تقنيات الPCR الي بتكشف مش عليDNA لا عن بروتين وبيتم استخدامها عشان يتم الكشف عن كميات قليله جدا من بروتين معين جوا عينه محدودة الكميه .. لذلك بتتم التقنيه علي كذا خطوة ..
1- بيكون متجهز primary Antibody اول ما بيلاقي البروتين المراد الكشف عنه بيمسك فيه
2- بعد كدة بيتم اضافه secondary Antibody حاصله attachment مع تسلسل من الDNA في احد اطرافه
3- بندخل ال microtiter plate دي مع مكونات ال real time PCR في الجهاز وزي الreal time PCR العادي بنقرأ الزيادة في معدل التضاعف من خلال florescence
4- تحليل النتايج ..لو تفاعل ال PCR تم واداني اشاره ده بيكون دليل علي وجود البروتين ده في العينه ..لو متمش او اداني اشاره ضعيفه بيكون اشاره علي وجود نسبه البروتين او عدمه في العينه
>> من ضمن عيوب التقنيه دي هي انها مكلفه بحيث دمج ال DNA مع الSecondary antibody ومحتاجه خبراء في التعامل معاها..
11- sanger sequencing
هي واحدة من اهم تقنيات الFirst generation Sequencing واتسمت بكدة نسبه للعالم الي ابتكرها وكانت واحدة من اهم التقنيات الي ساعدت في تقدم ال sequencing واهم خطواته (مشروع الجينوم البشري) وبيكون غرض التقنيه طبعا هي معرفه تتابعات ال DNA او قرايته علي الجيل .
بيتم تحضير التقنيه عن طريق
1- تحضير 4 اوساط تحتوي علي مكونات ( انزيم بلمرة DNA polymerase - وجزيئات معلمة dideoxynucleotide , كل وسط يحتوي علي نوع معين من القواعد المعلمه – ونيوكلوتيدات DNA حرة Adenine-cytosine-thiamine-guanine )
2- ثم يتم اضافة القطع الي الاوساط المختلفة وتركها فترة تسمح بتكرار DNA من خلال انزيم ال DNA polymerase
3- ومن ثم يتم تحميل العينات الي capillary electrophoresis واخذ بيانات التسلسل اللى هتعدى من خلال الانبوبة ديه وهنا هيتم الفصل ومن خلال تعريض ليزر على النيكليوتيدات المارة خلال الانبوبة سيتم تحليل البيانات عن طريق ظهور Peaks مختلفة للنيوكليوتيدات المارة وهنا سيتم قراءة التسلسل.
12- pyrosequencing
طريقة لمعرفة الDNA sequence عن طريق تحديد انتاج ال pyrophosphate عن طريق تحديد الضوء الخارج..
تضاف النيوكليوتيدات بشكل متكرر إلى التفاعل ، يتم إطلاق بيروفوسفات (PPi).
يؤدي PPi إلى سلسلة من التفاعلات التي تؤدي إلى إنتاج الضوء ، والذي يتناسب مع كمية الحمض النووي وعدد النيوكليوتيدات المدمجة.
يتم الكشف عن الضوء المولد وتسجيله بواسطة Detector system على شكل .signal peaks .
يتم تحضير قطع DNA مع استخدام انزيمات DNA polymerase و ATP sulfurylase و Apyrase و luciferin substrate.
1- يرافق كل حدث دمج للنيوكليوتيدات إطلاق مادة بيروفوسفات (PPi)
2- إطلاق PPi يؤدي إلى تفاعل ATP sulfurylase وهذا يؤدى لتحويل البيروفوسفات الى ATP
3- يقوم انزيم ال luciferase محول الATP الى light هنا نقدر نعملها detection
3- ويجي انزيم الapyrase يشيل الnucleotide الزيادة الي مش تبع التتابع المطلوب
وبعدين تطلع النتائج في شكلgraph والداتا علي حسب الpeak
هو زيSanger method بس مش بنفس الكفائة ، كفائته 98% وده مش وحش خالص غير إنه كمان أرخص ومتوفر أكتر تجارياً.
13 - CHIP-SEQ
وهى طريقة تستخدم لتحديد مواقع ربط الحمض النووى(DNA) على نطاق الجينوم بعوامل النسخ Transcription Factors والبروتينات الأخرى ، عن طريق دمج خاصيتين وهم
(immunoprecipitation)مع (DNA sequencing)
عن طريق :
1- ترسيب ال DNA اللى يرتبط بالبروتين باستخدام antibodies يعملtargeting للبروتينات ديه.
2- فصل ال DNA عن البروتين.
3- عمل DNA Sequencing لتحديد مواقع ارتباط البروتين على ال DNA.
14- edman degradation
وهي تقنيه من تقنيات معرفه تسلسل البروتين بيتم فيها استخدام مركب phenylisothiocyanate ال
N-Terminal animo acid للتفاعل مع
وبعد مجموعه من التفاعلات الحمضيه بيحصل فصل للحمض الاميني الطرفي الي مربوط مع ال phenylisothiocyanate
وبتتكرر العمليه دي اكتر من مرة عشان تعرفنا تسلسل البروتين ده ايه ..
طبعا العمليه دي بتاخد وقت ومجهود وفيها نسبه خطأ كبيرة لو كان البروتين حجمه كبير نسبيا لكن كانت واحدة من الطرق الاوليه لمعرفه تسلسل البروتين
15- Chromatography
- ال Chromatography هى تقنية مختبرية لفصل الخليط...
- يذوب الخليط في سائل يسمى الطور المتحرك Mobile phase، والذي يحمله من خلال هيكل يحمل مادة أخرى تسمى المرحلة الثابتةStationary Phase.
- تنتقل المكونات المختلفة للخليط بسرعات مختلفة ، مما يؤدي إلى انفصالها. يعتمد الفصل على التقسيم التفاضلي بين المرحلتين المتنقلة والثابتة!
16- Molecular typing techniques
عشان نقدر نعرف بكتريا معينه فساعتها بنلجأ ل اكتر من طريقه منهم الطرق الchemical reactions الي بتعتمد علي افرازات معينه من البكتريا وتفاعلها مع البيئه او طرق molecular ودي كتير جدا منهمELISA ومنهمPCR ومنهمsequencing ..
بس احنا هنا هنهتم بالsequencing اكتر في طرق قديمه وطرق حديثه شويه من اهم الطرق دي :
16s rRNA:
ودي بتتم عن طريق استخراج وعزل ال DNA وعمل PCR خاص بالجزء الخاص بال 16s rRNA الخاص بالبكتريا دي بعد كدة استخدام الhigh throughput sequencing لل 16s rRNA عشان نعرف تتابع الجزء ده وانتمائه ل اي نوع بكتريا وفصيله ونقدر نحلل بياناته ونحطه فيphylogeny خاص بيه..
MLST Multi-locus sequence typing :
وده بيعتمد علي استخدام اكتر من house-keeping gene جوا البكتريا علي عكس ال 16s rRNA اللى بيستهدف جين واحد بس ،وفى الاغلب بيكونوا 7 جينات مستهدفه وبتكون من ضمن مزاياه انه بيدي رقم ثابت لكل تسلسل فريد في كل كل جين وبيتم جمعهم عشان يديني كود مخصوص بيعرف ويثبت البكتريا دي بخصائصها وتسلسلها .. وكمان ليها database خاصه بيها( https://pubmlst.org/ ).
PULSED field gel electrophoresis :
وهنا احنا بنستخدم انزيمات قطع (restriction enzyme) عشان نقطع الجينوم البكتيري لقطع كبيرة وطبعاpattern القطع بيختلف حسب البكتريا والجينوم الي بيغير معاه طبعا الsite الي بيتم القطع فيه وبيتم تحميل القطع دي عليpulsed field gel والي بيكون شكله سداسي نوعا ما عشان نقدر نغير في اتجاه التيار الكهربي ويدينا pattern معين ومن ضمن الي بيميزه عن ال gel electrophoresis العادي في كتير من الحاجات اولهم انه بيقدر يحمل حجم اكبر من الdna من العادي وكمان خطواته الي بتكون
1- مزج البكتريا مع melted agarose gel
2- تقطيع الجينوم بعدد محدود من القطع
3- تحميل القطع علي ال PFGE
4- تصوير العينات ..
من ضمن عيوب التقنيه دي هي انها بطيئه بتاخد اكتر من يوم للتحضير
وطبعا من اهم الطرق استخدام ال Whole genome sequencing
والي بيدي تفاصيل اكتر عن البكتريا الي محتاجين نعرفها عشان نقدر نعملهاcharacterization عشان نقد نصمم ليها الطرق الرئيسية لتثبيط الوباء والقضاء عليه.
17- Ames assay
اختبار بعرف بيه لو الماده الي معايا دي ممكن تسبب طفرات او لا
عن طريق اني بحط الماده دي مع بكتريا متحورةmutant مبتقدرش تخلق الHistidine وبالتالي مش هتقدر تنمو لو مش موجود في الوسط بتاعها لكن لو حصلها طفرة فهي هتقدر ترجع تاني تخلقه وبالتالي لو حضنت البكتريا لمدة 24 ساعه مع المادة في وسط مفيهوش Histidine مش هتنمو ..
دي تقنيه من الطرق الي بستخدمها عشان اقيم المادة الي عندي ولكنها مش الوحيدة وواحدة من عيوبها هي انها ممكن تحصل طفرة تلقائيه ميكونش السبب فيها هي المادة دي ولكن بنقدر نفرق بينهم عن طريق النمط الخاص بالنمو البكتيري علي الطبق.
18 - Comet Assay
واحد من الاختبارات اللى بتكشف عن الكسور او ال Damage اللى بيحصل فى ال DNA..
بيتم عن طريق
1- وضع الخلية فى low melting agarose ،
2- وبعدها بيتم تحليل الخلايا فى ظروف قاعدية alkaline ، و محلول تحليلlysis solution عشان نضمن ان مفيش اى شوائب من الprotein ، ونضمن ان ال DNA يفك ويكون unwinded ..
3- بعدها بنعرض الشريحة إلىelectrophoresis و نصبغها ..
فا بالتالى يكون هناك حركة مرئية للجزيئات(Damaged DNA) بفعل التيار الكهربى بعيدا عن ال intact DNA
19 - Mutagenesis
هى طريقة من خلالها يتم عمل mutation معينة لل DNA لانتاج غرض معين..
قد ينتج عن الطفرة بروتينات متحولة ذات خصائص مثيرة للاهتمام أو وظائف محسنة أو جديدة قد تكون ذات فائدة تجارية.
توجد العديد من طرق الطفرات اليوم .. في البداية ، كانت الطفرات التى يتم انتاجها معمليا كانت بصورة عشوائية وغير متخصصة تمامًا. ومع ذلك ، مع التطور توصل الى ان الطفرات تكون موجهة للموقع ، يمكن إجراء تغييرات أكثر تحديدًا .. فمنذ عام 2013 ، سمح تطوير تقنية CRISPR / Cas9، استنادًا إلى نظام دفاع فيروسي بدائي النواة ، بتحرير أو تغيير الجينوم في الجسم الحى وهو ثورة فى عالم ال Genome editing لعلاج الامراض الوراثية وتطوير حالة النبات من الجفاف ومقاومة الامراض
