أهم 20 تقنية في التكنولوجيا الحيوية: دليلك الشامل لمستقبل البحث العلمي

أهم 20 تقنية في التكنولوجيا الحيوية: استكشاف التطور العلمي

التكنولوجيا الحيوية (Biotechnology) تُعد من أهم مجالات العلوم الحديثة، حيث تعتمد على تقنيات متقدمة لتحليل وتطوير المواد الحيوية مثل الحمض النووي والبروتينات. بفضل التكنولوجيا الحيوية، أصبح بالإمكان تطوير أدوية جديدة، دراسة الأمراض الوراثية، وتحسين المحاصيل الزراعية. في هذا المقال، سنتناول أهم 20 تقنية تُستخدم في التكنولوجيا الحيوية وأهميتها في تطوير البحث العلمي.

1- RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism):

• في علم البيولوجيا الجزيئية، تقنية RFLP تستغل الاختلافات في تسلسلات الحمض النووي المتجانسة، والمعروفة باسم polymorphism، من أجل التمييز بين الأفراد أو السكان أو الأنواع، أو لتحديد مواقع الجينات داخل التسلسل.
• وهي اختلافات بين الأفراد في أطوال قطع DNA التي تقطعها الإنزيمات.
  إنزيمات القطع – Restriction enzymes هي إنزيمات تقطع الحمض النووي في تسلسلات قصيرة وفي أماكن محددة تُسمى مواقع القطع – Restriction sites.
• بعد قطع جزء من الحمض النووي إلى قطع عن طريق إنزيمات القطع، يمكن للباحثين فحص القطع المختلفة باستخدام طريقة مخبرية تُسمى التفريد الكهربائي - gel electrophoresis، والتي تفصل قطع الحمض النووي وفقًا لحجمها.
• إذا كان لدى شخصين اختلافات في تسلسلات الحمض النووي في مواقع القطع، فإن إنزيمات القطع ستُنتج قطعًا ذات أطوال مختلفة.
• قد يكون هناك أيضًا اختلافات في عدد أجزاء الحمض النووي التي لوحظت بين شخصين أو أكثر.
• يمكن استخدام تحليل RFLP كشكل من أشكال الاختبار الجيني لمراقبة ما إذا كان الفرد يحمل جينًا متحورًا لمرض ينتشر في عائلته.

خطوات استخدام RFLP لتحديد النمط الوراثي:

1. استخراج DNA من العيّنتين.
2. قطع الحمض النووي باستخدام restriction enzyme.
3. تحميل العينات على gel electrophoresis لتحليل الاختلافات.

2- Native PAGE

• Native PAGE هو أحد التقنيات المستخدمة في تكنولوجيا التفريد الكهربي أو الـGel Electrophoresis.
• يُستخدم لتحديد الشكل والشحنة والوزن الطبيعي للبروتين.
• في هذه التقنية، يتم فصل البروتين في حالته الأساسية ثلاثية الأبعاد (Native protein) حيث لا يتم عمل denaturation للبروتين.
• يعتمد الفصل على أن معظم البروتينات تكون سالبة الشحنة (negatively charged) في المحلول القلوي الخاص بهذه التقنية. وعند تعريض البروتينات إلى gel electrophoresis، كلما كانت شحنة البروتين السالبة عالية في المحلول القلوي زادت سرعة حركته (migration) في الجيل.
• أثناء الفصل، تحدث قوة احتكاك بين البروتينات المختلفة والجيل، مما يؤدي إلى أن البروتينات الصغيرة تحتك بالجيل أقل من البروتينات الكبيرة. وبالتالي، يتم التحكم في الحركة والفصل بناءً على الحجم والشكل ثلاثي الأبعاد.
• بناءً على ذلك، يتم فصل البروتين بناءً على الشحنة والحجم والشكل ثلاثي الأبعاد، وليس بسبب توحيد الشحنة أو عمل denaturation كما يحدث في SDS PAGE

3- Microarray

• Microarray هي واحدة من أهم التقنيات في مجال biotechnology، حيث تُستخدم لقياس التعبير الجيني لجينات معينة في العينة ومقارنة التعبير الجيني الطبيعي للجينات في الخلايا الطبيعية بنظيرتها في الخلايا السرطانية.
• تتم التقنية عن طريق عملية التكامل (hybridization) بين أجزاء مكملة للجين (probe) التي يتم وضعها على شريحة لتتفاعل مع cDNA الخاص بالعينة، مما يساعد في تحليل التعبير الجيني.
• تُستخدم تقنيات مختلفة مثل protein microarray، وعلى الرغم من ظهور تقنيات أكثر دقة وقوة لاحقًا، لا تزال تقنية microarray تحتفظ بأهميتها ورونقها.

خطوات تقنية Microarray:

1. أولاً، يتم استخراج mRNA من كلتا العينتين: الخلية السرطانية والخلية الطبيعية.
2. ثم يتم تحويل mRNA إلى cDNA.
3. يتم تمييز cDNA الخاص بالعينة السرطانية باستخدام fluorescent dye باللون الأحمر، بينما يتم تمييز cDNA الخاص بالعينة الطبيعية (healthy) باللون الأخضر.
4. يتم تعريض cDNA للشريحة الخاصة بتقنية microarray.
5. عند حدوث عملية hybridization بين الشريحة والعينة، تظهر الإشارات الفلورية (fluorescent).
6. يتم الكشف عن هذه الإشارات باستخدام laser beam.
7. تُحلل البيانات الناتجة عن طريق الكمبيوتر لفهم وتفسير نتائج التعبير الجيني.

هذه الخطوات تُبرز دقة تقنية microarray ودورها الفعّال في دراسة التعبير الجيني وتحليل الفروقات بين الخلايا الطبيعية والخلايا السرطانية

4 – Southern Blotting

تقنية Southern blotting هي واحدة من تقنيات الـ blotting (اللطخة)، وهي مجموعة من التقنيات التي تُستخدم للكشف (detection) عن مكون معين أو هدف محدد. تُستخدم هذه التقنية لتحديد وجود تتابع معين من DNA داخل العينة. تعتبر Southern blotting من التقنيات الثورية التي سُميت على اسم العالم الذي ابتكرها، وتم استلهام تسميات باقي تقنيات الـ Blotting التي ظهرت لاحقًا من نفس النهج.

خطوات تقنية Southern Blotting:

1. استخلاص الـ DNA من العينة.
2. تقطيع الـ DNA باستخدام Restriction enzyme.
3. تحميل العينات على الـ gel electrophoresis لفصل القطع المختلفة بناءً على حجمها.
4. نقل الـ bands إلى nylon paper باستخدام الخاصية الشعرية (capillary action).
5. إضافة probes معلمة ومكملة للتتابع المراد الكشف عنه على الـ nylon paper، مما يُمكّن الباحث من تحديد وجود تتابع الـ DNA المستهدف داخل العينة.

تُعد Southern blotting من الأساليب الدقيقة والمهمة في الأبحاث الجزيئية، حيث تُستخدم بشكل واسع في تحليل الجينات ودراسة الأنماط الوراثية

5- Northern Blotting

على نفس نهج Southern blotting، تتيح تقنية Northern blotting تحديد وجود تتابع mRNA في العينة.

خطوات Northern Blotting:

1. عزل الـ RNA من العينة (RNA Extraction).
2. فصل الـ RNA حسب الحجم باستخدام electrophoresis داخل Alkaline gel، حيث يُفصل بناءً على طول السلاسل.
3. نقل الـ RNA إلى غشاء nylon membrane، وهي خطوة الـ blotting الأساسية.
4. إضافة labeled probes مخصصة لترتبط بالتتابع المستهدف من الـ RNA. بعد الارتباط، تظهر إضاءة فلوريسنتية يتم الكشف عنها لتحديد وجود التتابع المطلوب.

ملاحظات:

• تُعد تقنية Northern blotting من الطرق الدقيقة في دراسة التعبير الجيني، حيث تُستخدم للكشف عن وجود mRNA ولتحديد مستويات التعبير الجيني لعينة معينة.
• تمثل هذه التقنية أداة أساسية في الأبحاث الجزيئية لتحليل النشاط الجيني وتحديد التغيرات التي قد ترتبط بحالات مرضية

6 - Western Blotting

في هذه التقنية، يتم الكشف عن وجود بروتين معين داخل العينة حتى إذا كان بكميات أقل من أن تتمكن ELISA أو الطرق المعملية العادية الأخرى من الكشف عنها. الخطوات المتبعة هي كالتالي:

خطوات Western Blotting:

1. استخراج البروتين من العينة (Protein Extraction): يتم فصل البروتين من بقية مكونات العينة.
2. فصل البروتين باستخدام تقنية التفريد الكهربائي SDS PAGE، حيث يتم فصل البروتينات بناءً على وزنها الجزيئي.
3. نقل البروتينات من الجيل إلى غشاء nitrocellulose sheet باستخدام جهاز blotting tank.
4. وضع الغشاء داخل جهاز آخر (blotting tank) وإضافة primary antibody مصمم خصيصًا للارتباط بالبروتين المستهدف.
   • يتم بعد ذلك إضافة secondary antibody، الذي يكون مرتبطًا بإنزيم معين يمكنه التفاعل مع substrate لإنتاج لون مرئي، أو قد يكون مرتبطًا بمادة radioactive labeled يمكن الكشف عنها.

ملاحظات:

• تُعتبر تقنية Western blotting أكثر دقة مقارنة بتقنيات مثل ELISA عند الكشف عن البروتينات بتركيزات منخفضة.
• تُستخدم هذه التقنية بشكل واسع في الأبحاث البيولوجية والطبية لتحديد وجود بروتينات محددة وفهم تفاعلاتها في الظروف المرضية

7- DOT Blotting

على عكس التقنيات السابقة، يُعتبر Dot Blotting نوعًا مختلفًا من تقنيات blotting، حيث يُستخدم sheet مباشرة لنقل وقياس العينة بشكل مباشر. في هذه التقنية، يُعد sheet هو المكان الأساسي الذي يتم فيه ارتباط العينة مع probe.

البروتوكول العام:

1. يتم وضع 1-2 ميكرولتر من العينة على غشاء nitrocellulose والسماح لها بالجفاف.
2. يُجرى incubation للغشاء باستخدام blocking buffer لتقليل حدوث أي non-specific binding.
3. بعد ذلك، تُضاف primary antibodies (الأجسام المضادة الأولية)، تليها secondary antibodies (الأجسام المضادة الثانوية).
4. بعد ارتباط الأجسام المضادة (antibody binding)، يتم تعريض الغشاء إلى chemiluminescent substrate.
5. يتم تصوير الغشاء لتحليل النتائج وتحديد وجود البروتين المطلوب في العينة.

ملاحظات:

• تُعد تقنية Dot Blotting أبسط وأسرع مقارنة بالتقنيات الأخرى مثل Western Blotting.
• تُستخدم هذه الطريقة عادةً لتحديد وجود البروتينات بشكل أولي، ولكنها لا تقدم تفاصيل دقيقة مثل تحديد الحجم الجزيئي للبروتين

9- ELISA

ELISA هي تقنية من تقنيات serological test التي تُستخدم للكشف عن المواد القابلة للذوبان وقياسها، مثل الببتيدات، البروتينات، الأجسام المضادة، والهرمونات. تعتمد التقنية على التفاعل بين antigen وantibody، مما يجعلها أداة فعّالة للكشف عن وجود العديد من المواد الحيوية في العينات، بما في ذلك الكشف عن فيروس الإيدز (HIV) في عينة المريض.

أنواع ELISA:

• Direct ELISA
• Indirect ELISA
• Sandwich ELISA
• Competitive ELISA

طريقة العمل:

1. استخدام Antigen: يتم استخراج Antigen من serum المريض وإضافته إلى plate تحتوي على Antibody خاص بـAntigen المستهدف.
2. عملية الغسل (Wash): يُغسل plate لإزالة المواد غير المرتبطة.
3. إضافة Secondary Antibody: يتم إضافة secondary antibody الذي يرتبط بـprimary antibody. يحتوي secondary antibody على إنزيم قادر على التفاعل مع substrate.
4. الكشف عن التفاعل: يتم إضافة substrate، وعند حدوث التفاعل، يظهر تغير في اللون أو إشارة فلورية تشير إلى وجود المادة المستهدفة.

الفرق بين Western Blotting وELISA:

1. الدقة: تقنية Western Blotting أكثر دقة وأقل عرضة للأخطاء مقارنة بـELISA.
2. نطاق الكشف: تُستخدم ELISA ليس فقط للكشف عن Antigen ولكن أيضًا عن Antibody في بعض الحالات، حيث توفر kits مخصصة تحتوي على Antigen بينما يكون serum يحتوي على Antibody.

مميزات ELISA:

• حساسة للغاية في الكشف عن مواد محددة.
• تُستخدم على نطاق واسع في التشخيص الطبي والأبحاث البيولوجية.
• توفر نتائج دقيقة في وقت قصير نسبيًا.

تقنية ELISA هي أداة أساسية في التحاليل البيولوجية، وتُستخدم في العديد من التطبيقات الطبية والبحثية. مع الفهم الصحيح للخطوات والأساس العلمي، يمكن أن تكون هذه التقنية فعّالة ودقيقة للكشف عن مجموعة واسعة من المواد

10- Immuno-PCR

Immuno-PCR هي تقنية متقدمة من تقنيات PCR تُستخدم للكشف عن البروتينات وليس الـDNA. تم تصميمها للكشف عن كميات صغيرة جدًا من بروتين معين داخل عينة ذات كمية محدودة. تعتمد التقنية على دمج مبادئ التفاعل المناعي مع تقنية التضخيم الجزيئي، مما يجعلها حساسة للغاية.

خطوات العمل:

1. إعداد Primary Antibody: يتم تجهيز primary antibody، الذي يتعرف على البروتين المستهدف ويرتبط به فور وجوده.
2. إضافة Secondary Antibody: يتم إضافة secondary antibody مرتبط بتسلسل DNA في أحد أطرافه.
3. إجراء التفاعل في Microtiter Plate: يتم إدخال الـmicrotiter plate، الذي يحتوي على العينات ومكونات real-time PCR، إلى الجهاز.
4. قراءة النتائج: يتم قياس الزيادة في معدل التضخيم من خلال fluorescence. إذا تم تفاعل الـPCR بنجاح وأظهر إشارة، فهذا يشير إلى وجود البروتين المستهدف في العينة. وإذا لم يحدث التفاعل أو كانت الإشارة ضعيفة، فهذا يدل على غياب البروتين أو وجوده بنسب ضئيلة جدًا.

عيوب التقنية:

• التكلفة العالية: عملية دمج تسلسل DNA مع الـsecondary antibody تتطلب تقنيات متقدمة ومواد مكلفة.
• تعقيد التنفيذ: التقنية تحتاج إلى خبراء متخصصين للتعامل مع الخطوات الدقيقة وضمان الحصول على نتائج دقيقة.

تُعتبر Immuno-PCR تقنية فعّالة للكشف عن كميات صغيرة جدًا من البروتين، مما يجعلها أداة قوية في الأبحاث البيولوجية والطبية. وعلى الرغم من تكلفتها وتعقيدها، فإن دقتها وحساسيتها العالية تُميزها عن التقنيات التقليدية الأخرى

11- Sanger Sequencing

تقنية Sanger Sequencing تُعد واحدة من أهم تقنيات First Generation Sequencing، وتم تسميتها نسبة إلى العالم الذي ابتكرها. لعبت التقنية دورًا محوريًا في تقدم عمليات sequencing، خاصة في مشاريع ضخمة مثل مشروع الجينوم البشري. تهدف التقنية إلى تحديد تسلسل DNA أو قراءته على الجيل.

خطوات التحضير:

1. إعداد الأوساط: يتم تحضير 4 أوساط تحتوي على:

   • إنزيم بلمرة DNA polymerase.
   • جزيئات معلمة من نوع dideoxynucleotide (كل وسط يحتوي على نوع معين من القواعد المعلمة).
   • نيوكليوتيدات DNA حرة (Adenine-Cytosine-Thymine-Guanine).

2. إضافة العينات: يتم إضافة القطع إلى الأوساط المختلفة، ثم تركها لفترة لتكرار الـDNA باستخدام DNA polymerase.

3. تحميل العينات: بعد ذلك، يتم تحميل العينات على جهاز capillary electrophoresis.

4. تحليل البيانات: يتم تمرير العينات داخل أنبوبة الفصل، حيث يتعرض كل نيوكليوتيد إلى شعاع ليزر. يتم الكشف عن البيانات من خلال ظهور peaks مختلفة للنيوكليوتيدات المارة، مما يتيح قراءة تسلسل DNA بدقة.

أهمية التقنية:

• لعبت دورًا حاسمًا في تحديد تتابعات الجينوم لأول مرة.
• تُستخدم لفحص التسلسل الجيني والتأكد من دقة النتائج.

على الرغم من وجود تقنيات أحدث وأكثر تطورًا، تظل Sanger Sequencing واحدة من التقنيات الأساسية التي أرست الأساس للابتكارات في مجال علم الجينات

12- Pyrosequencing

تقنية Pyrosequencing هي طريقة مبتكرة لمعرفة تسلسل الـDNA عن طريق الكشف عن إنتاج Pyrophosphate (PPi) من خلال تحديد الضوء الناتج عن التفاعل.

آلية العمل:

• تُضاف النيوكليوتيدات بشكل متكرر إلى التفاعل، ويتم إطلاق PPi مع كل عملية دمج نيوكليوتيد.
• يؤدي إطلاق PPi إلى سلسلة من التفاعلات التي تُنتج الضوء. شدة الضوء الناتج تكون متناسبة مع كمية الحمض النووي وعدد النيوكليوتيدات المدمجة.
• يتم الكشف عن الضوء باستخدام Detector system وتسجيله على شكل signal peaks.

خطوات العمل:

1. إطلاق الـPPi: كل مرة يتم فيها دمج نيوكليوتيد، يُطلق Pyrophosphate (PPi).
2. تحويل الـPPi: يعمل إنزيم ATP sulfurylase على تحويل PPi إلى ATP.
3. إنتاج الضوء: يقوم إنزيم luciferase باستخدام ATP لإنتاج الضوء الذي يمكن الكشف عنه بسهولة.
4. إزالة النيوكليوتيدات الزائدة: يعمل إنزيم apyrase على إزالة النيوكليوتيدات غير المتوافقة أو الزائدة لضمان الدقة.
5. تحليل النتائج: تظهر النتائج على شكل graph، حيث يتم تحليل القيم بناءً على peaks للإشارة إلى تسلسل الحمض النووي.

مقارنة بـ Sanger Sequencing:

• الدقة: تمتاز تقنية Pyrosequencing بدقة تصل إلى 98%، وهي أقل قليلاً من Sanger Method، لكنها ما زالت موثوقة.
• التكلفة: أرخص من Sanger Method، مما يجعلها خيارًا مفضلًا للكثير من التطبيقات.
• التوافر: تُعتبر أكثر توفرًا تجاريًا وأسهل في الاستخدام.

مميزات التقنية:

• توفر نتائج سريعة.
• تستخدم أدوات أقل تكلفة.
• مناسبة لتحليل الجينوم الصغير أو المحدود.

على الرغم من وجود تقنيات أحدث وأكثر تطورًا، تظل Pyrosequencing خيارًا فعالًا في العديد من التطبيقات الجينية بفضل كفاءتها وسهولة استخدامها

13- CHIP-SEQ

تقنية CHIP-SEQ هي طريقة متقدمة تُستخدم لتحديد مواقع ارتباط الحمض النووي (DNA) بعوامل النسخ (Transcription Factors) أو البروتينات الأخرى على نطاق الجينوم. تعتمد هذه الطريقة على دمج خاصيتين رئيسيتين:

1. Immunoprecipitation: ترسيب الحمض النووي المرتبط بالبروتين.
2. DNA Sequencing: تحديد تسلسل الحمض النووي لفحص مواقع الارتباط.

خطوات العمل:

1. ترسيب الحمض النووي المرتبط بالبروتين: يتم استخدام Antibodies لاستهداف البروتينات المرتبطة بالحمض النووي والتي نريد دراستها.
2. فصل الحمض النووي عن البروتين: يتم فصل الحمض النووي باستخدام تقنيات متخصصة لتحليله بشكل منفصل.
3. إجراء تسلسل الحمض النووي: تُستخدم تقنية DNA Sequencing لتحديد مواقع ارتباط البروتينات على الحمض النووي.

أهمية التقنية:

• تُستخدم لفهم كيفية تنظيم الجينات.
• توفر بيانات دقيقة حول مواقع ارتباط عوامل النسخ والبروتينات.
• تُساهم في الأبحاث المتعلقة بتنظيم الجينات والأمراض المرتبطة بالطفرات الجينية.

CHIP-SEQ تُعتبر أداة قوية في مجال الأبحاث الجينومية والجزيئية لفهم دور البروتينات في تنظيم الجينات على مستوى الجينوم الكامل

14- Edman Degradation

Edman Degradation هي تقنية تُستخدم لمعرفة تسلسل الأحماض الأمينية في البروتين. تعتمد هذه الطريقة على استخدام مركب Phenylisothiocyanate الذي يتفاعل مع الحمض الأميني الطرفي N-Terminal Amino Acid.

خطوات العملية:

1. يتفاعل مركب Phenylisothiocyanate مع الحمض الأميني الطرفي للبروتين.
2. بعد سلسلة من التفاعلات الكيميائية الحمضية، يتم فصل الحمض الأميني الطرفي المرتبط بمركب Phenylisothiocyanate.
3. تتكرر هذه العملية عدة مرات لاستخلاص كل حمض أميني على التوالي، مما يسمح بتحديد التسلسل الكامل للبروتين.

ملاحظات هامة:

• العملية تتطلب وقتًا وجهدًا كبيرين، خاصة إذا كان البروتين ذو حجم كبير.
• نسبة الخطأ في التقنية مرتفعة نسبيًا مع البروتينات المعقدة أو كبيرة الحجم.
• بالرغم من محدودية كفاءتها مقارنة بالطرق الحديثة، إلا أنها كانت إحدى الوسائل الأولية والأساسية لمعرفة تسلسل البروتين.

تُعتبر Edman Degradation من الطرق التاريخية التي ساهمت في تقدم مجال دراسة البروتينات وفهم تركيبها وتسلسلها، على الرغم من ظهور تقنيات أكثر دقة وكفاءة في الوقت الحالي

15- Chromatography

Chromatography هي تقنية مختبرية تُستخدم لفصل مكونات الخليط.

طريقة العمل:

1. يُذاب الخليط في سائل يُعرف باسم الطور المتحرك (Mobile Phase).
2. يتم حمل الخليط من خلال هيكل يحتوي على مادة أخرى تُسمى المرحلة الثابتة (Stationary Phase).
3. تنتقل المكونات المختلفة للخليط بسرعات متفاوتة خلال الهيكل، مما يؤدي إلى انفصالها عن بعضها البعض.

مبدأ الفصل:

يعتمد الفصل في Chromatography على التقسيم التفاضلي بين المرحلتين المتنقلة والثابتة. كل مكون في الخليط يتفاعل مع الطور المتحرك والثابت بشكل مختلف، مما يحدد سرعة انتقاله وبالتالي فصله عن المكونات الأخرى.

تُعتبر هذه التقنية من أهم الطرق المستخدمة في التحليل الكيميائي لفصل وتحديد مكونات المركبات في مختلف التطبيقات العلمية والصناعية.

16- Molecular Typing Techniques

لتحديد نوع معين من البكتيريا، يمكن اللجوء إلى عدة طرق تشمل التفاعلات الكيميائية (chemical reactions) التي تعتمد على إفرازات معينة من البكتيريا وتفاعلها مع البيئة، أو الطرق الجزيئية (molecular techniques) مثل ELISA وPCR وsequencing.

الطرق الحديثة والقديمة في الـ sequencing:

1. 16s rRNA:

   • تعتمد هذه الطريقة على استخراج وعزل DNA.
   • يتم إجراء PCR للجزء الخاص بـ 16s rRNA للبكتيريا.
   • يتم استخدام high throughput sequencing لتحليل تتابع 16s rRNA، وتحديد انتماء البكتيريا لأي نوع أو فصيلة.
   • البيانات الناتجة يتم تحليلها ووضعها في شجرة تطور جيني phylogeny.

2. MLST (Multi-locus Sequence Typing):

   • تعتمد هذه الطريقة على استخدام أكثر من house-keeping gene داخل البكتيريا، بعكس 16s rRNA الذي يركز على جين واحد فقط.
   • غالبًا يتم اختيار 7 جينات مستهدفة.
   • تتميز الطريقة بإعطاء رقم ثابت لكل تسلسل فريد في كل جين، ويتم جمع هذه الأرقام لإنتاج رمز فريد يحدد خصائص البكتيريا وتسلسلها.
   • يتم تخزين النتائج في قواعد بيانات خاصة مثل pubmlst.org.

3. PULSED Field Gel Electrophoresis (PFGE):

   • تعتمد على استخدام restriction enzymes لتقطيع الجينوم البكتيري إلى قطع كبيرة.
   • يتم فصل هذه القطع باستخدام جهاز pulsed field gel الذي يُغير اتجاه التيار الكهربائي، مما ينتج عنه نمط pattern مميز لكل نوع من البكتيريا.
   • خطوات الإجراء:
     1. مزج البكتيريا مع melted agarose gel.
     2. تقطيع الجينوم باستخدام عدد محدود من الإنزيمات.
     3. تحميل القطع على جهاز PFGE.
     4. تصوير العينات للحصول على الأنماط المميزة.
   • عيوب الطريقة: بطيئة وقد تستغرق أكثر من يوم للتحضير.

4. Whole Genome Sequencing (WGS):

   • تُعد من أكثر الطرق تطورًا.
   • تقدم تفاصيل دقيقة حول البكتيريا، مما يساعد في تصميم استراتيجيات فعالة لتثبيط الأمراض والقضاء عليها.

أهمية هذه التقنيات:

• تُستخدم هذه التقنيات لتصنيف البكتيريا وتحديد خصائصها بدقة.
• تساعد في رسم خرائط جينية للبكتيريا، مما يسهم في تحسين أساليب العلاج والتعامل مع الأوبئة البكتيرية.

17- Ames Assay

اختبار Ames assay هو تقنية تُستخدم لتحديد ما إذا كانت المادة التي يتم اختبارها قادرة على إحداث طفرات (mutations) أم لا.

آلية العمل:

1. يتم استخدام بكتيريا متحورة (mutant bacteria) غير قادرة على إنتاج Histidine، وبالتالي لا يمكنها النمو إلا إذا كان هذا العنصر موجودًا في الوسط الغذائي.
2. يتم تعريض هذه البكتيريا للمادة المراد اختبارها.
   • إذا تسببت المادة في حدوث طفرة، فستتمكن البكتيريا من إنتاج Histidine مرة أخرى وتنمو في وسط خالٍ من هذا العنصر.
   • أما إذا لم تحدث طفرة، فلن تنمو البكتيريا في الوسط الخالي من Histidine.
3. تُحضن البكتيريا لمدة 24 ساعة مع المادة تحت الاختبار في وسط خالٍ من Histidine، ويتم ملاحظة النمو البكتيري.

المميزات:

• تُعد هذه التقنية من الأدوات المفيدة لتقييم احتمالية تأثير مادة معينة على الحمض النووي.

العيوب:

• قد تحدث طفرات تلقائية لا علاقة لها بالمادة المختبرة، مما قد يؤدي إلى نتائج غير دقيقة.
• يتم التمييز بين الطفرات التلقائية والطفرات الناتجة عن المادة باستخدام أنماط النمو البكتيري المميزة على الطبق.

التطبيقات:

• تُستخدم التقنية في الصناعات الدوائية والكيميائية لتحديد سلامة المركبات الجديدة قبل استخدامها على نطاق واسع

18- Comet Assay

اختبار Comet Assay هو تقنية تُستخدم للكشف عن الكسور أو التلف (Damage) الذي يحدث في DNA.

خطوات الإجراء:

1. يتم وضع الخلايا في low melting agarose للحفاظ على سلامة الحمض النووي.
2. تُعرّض الخلايا لتحليل في ظروف قاعدية (alkaline) باستخدام محلول تحليل (lysis solution) لضمان إزالة أي شوائب من البروتين، والتأكد من فك الحمض النووي (unwinding).
3. بعد التحليل، يتم تعريض الشريحة لتقنية electrophoresis لتفصل الجزيئات.
4. تُصبغ الشريحة لتحديد الحمض النووي التالف، حيث يمكن ملاحظة حركة مرئية للجزيئات (Damaged DNA) بفعل التيار الكهربائي، والتي تتحرك بعيدًا عن intact DNA.

المخرجات:

• الجزيئات التالفة (Damaged DNA) تظهر بشكل يشبه "الذيل" في الصورة الناتجة، مما يمنح التقنية اسمها (Comet Assay) نظرًا لشبهها بالمذنب.
• يساعد هذا الاختبار في تحديد مدى تلف الحمض النووي بدقة.

الاستخدامات:

• يُستخدم في أبحاث السموم الجينية.
• تقييم تأثيرات الأدوية أو العوامل البيئية على الحمض النووي.
• قياس استجابة الخلايا للإجهاد أو العلاجات المختلفة

19 - Mutagenesis

Mutagenesis هي تقنية تُستخدم لإحداث mutation معينة في DNA بهدف تحقيق غرض محدد.

الغرض من الطفرات:

قد تؤدي الطفرات إلى إنتاج بروتينات متحولة ذات خصائص جديدة أو محسّنة، قد تكون ذات أهمية كبيرة في التطبيقات التجارية والصناعية.

أنواع الطفرات:

1. الطفرات العشوائية:

   • كانت تُجرى في البداية بشكل غير موجه، حيث يتم إحداث الطفرات بصورة عشوائية.
   • كانت هذه الطريقة تُستخدم على نطاق واسع لكنها لم تكن دقيقة بما يكفي.

2. الطفرات الموجهة:

   • مع تقدم الأبحاث، أصبح بالإمكان توجيه الطفرات نحو مواقع محددة داخل الجينوم.
   • هذه الطريقة توفر تغييرات دقيقة وفعّالة.

تطورات حديثة:

• في عام 2013، تم تطوير تقنية CRISPR / Cas9، التي تستند إلى نظام دفاع فيروسي موجود في بدائيات النوى.
• تسمح التقنية بتحرير الجينوم في الجسم الحي، مما يُعد ثورة في مجال Genome editing.
• من خلال هذه التقنية، يمكن معالجة الأمراض الوراثية، تحسين مقاومة النباتات للجفاف، ومكافحة الأمراض الزراعية.

الفوائد:

• تحسين الخصائص الوراثية للنباتات والحيوانات.
• إنتاج أدوية جديدة أو تطوير علاجات مبتكرة.
• تعزيز مقاومة المحاصيل الزراعية للأمراض والجفاف.

أهمية التقنية:

Mutagenesis تُمثل حجر الزاوية في مجال الهندسة الوراثية والتكنولوجيا الحيوية، حيث توفر إمكانيات لا حصر لها لتحسين الحياة البشرية والزراعية والصناعية.

20. CRISPR-Cas9: ثورة في تعديل الجينات

CRISPR-Cas9 هي تقنية ثورية في مجال Genome Editing تُستخدم لتحرير الجينوم بدقة وفعالية. تعتمد التقنية على نظام دفاع مناعي موجود في البكتيريا لحمايتها من الفيروسات الغازية، وتم تطويرها لاستخدامها في تعديل الجينات في الكائنات الحية المختلفة.

كيفية عمل CRISPR-Cas9:

1. التعرف على الجين المستهدف:
   يتم استخدام دليل RNA (sgRNA) مصمم بشكل مخصص للتعرف على تسلسل الحمض النووي المطلوب تعديله.

2. قص الحمض النووي:
   بروتين Cas9 يعمل كمقص جيني يقطع الحمض النووي عند الموقع المستهدف بدقة عالية.

3. تصحيح أو تعديل الجين:
   بعد القص، يتم إدخال تعديلات جينية مثل:

   • تصحيح الطفرات الجينية.
   • حذف تسلسلات غير مرغوب فيها.
   • إدخال تسلسلات جديدة لتحسين الصفات.
     
     

     استخدامات CRISPR-Cas9:

     1. علاج الأمراض الوراثية:

     • تُستخدم لتعديل الطفرات المسؤولة عن الأمراض الوراثية مثل التليف الكيسي، وفقر الدم المنجلي.
     • أظهرت دراسات سريرية نتائج واعدة في علاج الأمراض المزمنة.

     2. تحسين المحاصيل الزراعية:

     • تعزيز مقاومة النباتات للجفاف والأمراض.
     • زيادة إنتاجية المحاصيل وجودتها.
     • تطوير محاصيل معدلة وراثيًا لمواجهة التغيرات المناخية.

     3. تطوير العلاجات المناعية:

     • تعديل الخلايا المناعية لمكافحة السرطان، مثل استخدام خلايا T المعدلة وراثيًا.
     • تحسين فعالية العلاج بالخلايا الجذعية.

     4. أبحاث الأمراض:

     • تُستخدم لدراسة الجينات المسببة للأمراض وفهم وظائفها بشكل أفضل.
     • تُساعد في تطوير أدوية جديدة تستهدف الجينات.